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      沪鼎生物科技小鼠胃动素(MTL)试剂盒操作流程

      发布时间:2022-03-30 点击量:42

      【预期用途】

      仅供科研使用,本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中胃动素(MTL)含量。


      【检测原理】

      本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠胃动素(MTL)水平。用纯化的小鼠胃动素(MTL)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入胃动素(MTL),再与HRP标记的胃动素(MTL)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胃动素(MTL)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中小鼠胃动素(MTL)浓度。 

      【操作步骤】

      1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

      图片1.png


      480pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

      240pg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

      120pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

      60pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

      30pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

      2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

      3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

      4.配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

      5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

      6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。 

      7.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

      8.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

      9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10-20分钟。

      10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

      11.测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

      注意:

      1.试剂准备:试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用。准备一次实验所需要的酶标条,其它的可从微孔板上拆下,密封,按照说明书要求保存,以备下次使用。

      2.加样:实验操作中请使用一次性的灭菌吸头,避免污染。加样时注意不要有气泡产生,将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样,加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔尽量小(一般控制在10 分钟以内),如果太大,将会导致不同的“预温育"时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。为了测值的准确性,推荐设置复孔进行实验。

      3.温育:为防止样品蒸发,实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内,以避免液体蒸发,洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态,同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

      4.洗涤:浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。充分洗涤非常重要,在每次洗涤过程中,都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水,同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机,请在熟练使用后再用于正式实验过程中。

      5.反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化,如观察到颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。

      6.底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。

      【结果计算】

        以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 

      图片2.png


























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